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作者：香雪生命科學(xué)研究中心-吳小瓊
發(fā)布時(shí)間：2019-02-28
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2018年10月3日，瑞典皇家科學(xué)院在斯德哥爾摩宣布，決定將2018年諾貝爾化學(xué)獎的一半授予美國科學(xué)家Frances H. Arnold的“酶的定向進(jìn)化”，而另一半則同時(shí)授予美國科學(xué)家George P. Smith和英國科學(xué)家Gregory P. Winter，表彰他們在噬菌體展示技術(shù)研究中的突出貢獻。這個(gè)技術(shù)到底是什么呢？是不是高冷到離大眾很遠呢？并不。以下我就來(lái)簡(jiǎn)單介紹一下噬菌體展示技術(shù)的基本原理及其應用吧。
圖1 （來(lái)源：The official website of the Nobel Prize）
（1）噬菌體展示技術(shù)的基本原理
談到噬菌體展示技術(shù)的原理，或許你首先會(huì )問(wèn)的第一個(gè)問(wèn)題是：什么是噬菌體？噬菌體是一種病毒，是一種必須通過(guò)感染細菌、真菌等微生物，“盜取”這些微生物的營(yíng)養物質(zhì)，才得以繁衍下一代的病毒，因為部分噬菌體會(huì )導致被感染的微生物裂解，因此才獲得了“噬菌體”的美名。生活中的噬菌體常見(jiàn)于細菌群落較多的地方，例如泥土或者動(dòng)物的腸道之中。由于噬菌體具有結構簡(jiǎn)單，培養方便和繁殖較快等優(yōu)點(diǎn)，因此在生物學(xué)實(shí)驗室中得到廣泛的應用。美國科學(xué)家George P. Smith發(fā)現在噬菌體的基因序列中插入一段外源的基因之后，不但不影響其生長(cháng)狀態(tài)與感染效率，并且該插入基因表達的外源蛋白還能被帶到噬菌體表面，1985年史密斯先生發(fā)表了他發(fā)現的該項技術(shù)，并將其稱(chēng)之為噬菌體展示技術(shù)。[1]
噬菌體展示技術(shù)的原理其實(shí)并不難理解，如圖2所示，科學(xué)家們將外源的目標多肽或蛋白的基因片段（紅色的基因片段）插入到噬菌體的結構基因（噬菌體內灰色的基因片段）的適當位置上，在不影響噬菌體其他外殼蛋白正常表達并且功能不發(fā)生改變的情況下，使外源的多肽或蛋白與噬菌體的外殼蛋白進(jìn)行融合表達，融合的蛋白分子會(huì )隨著(zhù)子代噬菌體的重新組裝而被展示在噬菌體表面。這些被展示在噬菌體表面的多肽或蛋白分子仍然保持其該有的生物活性，并且具有相對獨立的空間結構，進(jìn)而能夠被靶分子識別與結合。
舉個(gè)簡(jiǎn)單的例子，就像果農們在一棵桃樹(shù)上嫁接上李子樹(shù)的枝條后，這一棵桃子樹(shù)上就能既長(cháng)出來(lái)桃子，同時(shí)也能長(cháng)出來(lái)李子。噬菌體展示技術(shù)也是相似的道理，它使得噬菌體既能“長(cháng)出”自身原有的蛋白，同時(shí)也能“長(cháng)出”我們所需要的其他“果實(shí)”，只不過(guò)這一技術(shù)是從基因水平開(kāi)始下手的。
圖2
要從噬菌體文庫中挑選中我們想要的噬菌體，也就是表達了目標分子的噬菌體，就要經(jīng)過(guò)篩選的過(guò)程，該過(guò)程被稱(chēng)之為“淘篩”。該過(guò)程簡(jiǎn)單地說(shuō)就是被展示在噬菌體表面的肽庫或者蛋白庫能夠特異地與目標抗原識別并結合，經(jīng)過(guò)足夠時(shí)間的孵育之后，可使用洗滌液洗去與抗原結合較弱或者未結合的游離噬菌體。隨后用酸堿洗脫液將特異性結合的目標噬菌體洗脫下來(lái)，接著(zhù)再用中和后的噬菌體感染宿主大腸桿菌并進(jìn)行擴增以得到下一輪的子噬菌體庫。隨后經(jīng)過(guò)3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴增”富集過(guò)程后，能夠與抗原特異性結合的噬菌體的比例得到了逐步提高。最終獲得能夠識別靶分子的多肽或者蛋白，可被用于后續的實(shí)驗。
這個(gè)過(guò)程我們按照圖3可以將其這樣理解：比如說(shuō)我們所需要的目標是一個(gè)表達了“一個(gè)圓球”的噬菌體顆粒（我們的抗原是一個(gè)“凹半圓形”的分子，他們是剛好可以相互嵌合的），當我們第一次將其放在一起的時(shí)候，或許除了表達了“一個(gè)圓球”的噬菌體顆粒可以結合到抗原上之外，由于抗原有富余等原因，外型有點(diǎn)類(lèi)似的表達了“兩個(gè)圓球”的噬菌體顆粒也能結合上去。而表達“方形”的噬菌體顆粒由于不匹配則被洗滌液沖洗掉了。通過(guò)感染大腸桿菌進(jìn)行擴增之后，該噬菌體庫里面就僅含有了“一個(gè)圓球”和“兩個(gè)圓球”兩種噬菌體顆粒。進(jìn)一步通過(guò)減少抗原的使用量的幾輪反復過(guò)程之后，就可以富集到一個(gè)富含“一個(gè)圓球”的噬菌體顆粒的文庫。從而可以挑選出了表達了我們所需的“果實(shí)”的噬菌體。
圖3
（2） 噬菌體展示技術(shù)的應用
日趨成熟的噬菌體展示技術(shù)憑借其具有高效、方便、靈活篩選等自身優(yōu)勢，目前已被應用于多個(gè)方面。例如，抗原表位分析、抗體制備、多肽藥物制備、疫苗制備以及疾病診斷與治療等，表1展示了噬菌體展示技術(shù)的部分應用實(shí)例。
表1 噬菌體展示技術(shù)的部分應用實(shí)例 [2]
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應用方向 |
應用實(shí)例 |
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抗原表位分析 |
囊尾蚴模擬表位 |
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治療性抗體的研發(fā) |
阿達木單抗 |
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抗體親和力成熟 |
抗P24抗體 |
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多肽藥物制備 |
艾卡拉肽 |
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疫苗研發(fā) 酶蛋白定向進(jìn)化 |
抗幽門(mén)螺桿菌疫苗 耐熱性的反轉錄酶 |
噬菌體展示技術(shù)在癌癥、自身免疫病的診斷及治療領(lǐng)域中備受關(guān)注，發(fā)揮著(zhù)重要的作用。談到噬菌體展示技術(shù)在單克隆抗體方面的應用，不得不提的是第一款由噬菌體展示技術(shù)帶來(lái)的藥物： Adalimumab（阿達木單抗），商品名為Humira。Humira的研發(fā)是生物醫藥歷史上的一大突破。上世紀80年代初澳大利亞的免疫學(xué)家Marc Feldmann教授在研究甲亢的時(shí)候，意外發(fā)現了IL-1（白細胞介素1）是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節炎的潛在病因，并且發(fā)現作用于TNF-α（腫瘤壞死因子-α）的抗體幾乎可以完全抑制IL-1的產(chǎn)生。但是他們當時(shí)獲得的該抗體是來(lái)自于小鼠，鼠源的抗體在進(jìn)入人體內后，會(huì )產(chǎn)生免疫反應，有潛在的副作用，就此該項研究到了瓶頸階段。隨后Gregory P. Winter教授通過(guò)噬菌體展示技術(shù)對TNF-α的鼠源抗體進(jìn)行改造，經(jīng)過(guò)多次優(yōu)化之后得到了完全人源化的抗體，也就是我們所知道的阿達木單抗。該抗體自從2002年美國FDA批準上市以來(lái)，已經(jīng)先后在全球超過(guò)100個(gè)國家和地區獲批上市，被用于治療包括類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節炎、強制性脊柱炎和銀屑病等15種不同的適應癥，為全球患者帶來(lái)了福音。據艾伯維官方數據顯示，2018年修美樂(lè )銷(xiāo)售額為199.36億美元，連續7年雄踞全球藥品銷(xiāo)售榜首，享有全球“藥王”之稱(chēng)。即使是目前在腫瘤治療領(lǐng)域中如日中天的PD-1單抗Keytruda也難以望其項背。隨著(zhù)噬菌體展示技術(shù)的深入研發(fā)與完善，相信其必在醫藥健康領(lǐng)域中發(fā)揮重要的作用。
參考文獻
1. G. P. Smith, Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 228, 1315-1317 (1985); published online Epub Jun 14
2. 曲戈，2018諾貝爾化學(xué)獎：酶定向進(jìn)化與噬菌體展示技術(shù)，生物學(xué)雜志。
