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作者：香雪精準醫療--張婷婷
發(fā)布時(shí)間：2020-06-23
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新型冠狀病毒感染導致的新型冠狀病毒肺炎疫情在數月內蔓延全球，是當前全球最為關(guān)注的公共健康問(wèn)題。截至2020年6月，全球累計確診人數超過(guò)700萬(wàn)人，累計死亡人數超四十萬(wàn)。相比于2003年的爆發(fā)的SARS新冠病毒的傳染性更強，在老年人和患基礎病人群中的帶來(lái)的危害更大[1]。2020年2月11日，國際病毒分類(lèi)委員會(huì )將該病毒正式命名為嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒-2（severe acute respiratory syndrome，SARS?CoV?2），同日世界衛生組織（WHO）將該病毒所引起的疾病命名為新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease?19，COVID?19）。
根據基因組分析，SARS?CoV?2 和SARS同屬于β冠狀病毒屬，屬于可感染人類(lèi)的并可引起疾病的冠狀病毒。SARS?CoV?2結構上是一種球形、有包膜的正鏈單股RNA 病毒。COVID-19 具有人群普遍易感性，傳染源主要為患者和無(wú)癥狀的感染者，飛沫和密切接觸為主要的傳播途徑，潛伏期 1～14天，多為 3～7天。因此建立高效、快速、準確的實(shí)驗室診斷方法對新冠肺炎早發(fā)現、早防控、早治療都極其重要。
目前最常用的實(shí)驗室快速檢測確定病原體的方法主要有兩大類(lèi)：基于遺傳物質(zhì)（DNA 或 RNA）的核酸檢測和基于免疫反應的蛋白（抗體）檢測。核酸是病毒的遺傳物質(zhì)，可選擇特異性的核酸序列進(jìn)行檢測即可確定病原體。而病毒作為抗原可激發(fā)人體免疫反應從而產(chǎn)生抗體，抗原抗體特異性結合可作為檢測確定病原體的第二類(lèi)方法。
1 核酸檢測方法
1.1 基因測序技術(shù)
眾所周知，基因組測序早已被的用于未知病毒的鑒定，該方法有助于我們更快，更全面的認識病毒了解病毒。病原體的基因組測序是目前最精確的檢測方法，同時(shí)還可以監測病毒是否發(fā)生變異[4]。COVID-19爆發(fā)以來(lái)，中國疾控中心在短時(shí)間內就從患者體內分離出病原體，通過(guò)測序技術(shù)確定了其基因序列，已于2020年1月12日向世衛組織提供。同時(shí)我國發(fā)現SARS?CoV?2與SARS-CoV 的核苷酸同源性約為80%。基因測序技術(shù)最大的優(yōu)勢在于其極高的準確性，適用于初期病毒的鑒定和后期病毒的研究，但是其儀器要求配置高，測序時(shí)間長(cháng)，導致其難以實(shí)現大規模的篩查。
1.2 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR
在第七版試行新型冠狀病毒肺炎診療方案中，將實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測技術(shù)定為疑似病例確診的標準之一，當有臨床癥狀和影像學(xué)指征的疑似病例具備實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測新冠狀病毒核酸陽(yáng)性即可確定為確診病例。實(shí)時(shí)熒光 PCR與普通 PCR區別在于反應體系中加入了熒光化學(xué)物質(zhì)，通過(guò)檢測最終熒光信號的強弱對目的基因進(jìn)行相對定量。根據SARS-CoV-2的全基因組序列，國家衛健委推薦新冠病毒的三個(gè)特異性區域（ORF1ab基因、N基因和E基因）作為PCR擴增區域［5］。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法具有高靈敏度，高特異性，適用樣本廣泛的優(yōu)勢，但是其涉及的實(shí)驗步驟多，檢測閾值受限等多方面的影響，導致其會(huì )出現假陰性的結果。
1.3 基因編輯技術(shù)
近年來(lái)，以CRISPR/Cas系統為代表的基因編輯技術(shù)在各個(gè)研究領(lǐng)域廣泛應用，基于CRISPR的SHERLOCK技術(shù)的核心是Cas13a蛋白酶和與其結合的向導RNA。根據新冠病毒的RNA序列，設計出能夠靶向新冠病毒特異性序列的向導RNA，當待測樣本中存在新冠病毒的RNA時(shí)，向導RNA即可精準的識別該特異性RNA，并同時(shí)激活與其結合的Cas13a蛋白酶，Cas13a轉入激活狀態(tài)后可無(wú)區分的切割RNA分子。據此設計出和RNA相連的報告分子，當Cas13a得到激活，報告分子上的RNA就會(huì )被切斷，當報告分子被切割時(shí)會(huì )釋放可檢測的熒光信號。在COVID-19 疫情暴發(fā)后，張峰團隊針對SARS?CoV?2 基因組中ORF1 ab 和 S蛋白基因分別設計出特異性向導 RNA，實(shí)現了基于 CRISPR / Cas系統的SARS?CoV?2 檢測。CRISPR / Cas檢測方法無(wú)需大型儀器設備支持、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高和結果可視化，應用前景廣闊。
1.4 恒溫擴增技術(shù)
恒溫擴增技術(shù)即利用引物、脫氧核糖核苷三磷酸、模板 DNA 及各種酶，在恒定溫度下進(jìn)行擴增[6] 。其中逆轉錄環(huán)介導等溫擴增(reverse transcription loop -mediated isothermal amplification, RT-LAMP)是針對靶基因上的多個(gè)區域設計多條引物，在60~65℃的恒溫條件下一步進(jìn)行 RNA 逆轉錄和核酸擴增的方法。RT-LAMP具有易于操作、快速及特異性高等優(yōu)勢，可作為一種快速篩查的檢測手段。但由于RT-LAMP的敏感性較高，極易受到污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性結果，故要嚴防操作污染。另外，當病毒載量低于RT-LAMP檢測下線(xiàn)時(shí)，可能引起假陰性的結果。
2 蛋白檢測方法
由于SARS?CoV?2的遺傳物質(zhì)為RNA，而RNA具有高突變率和不穩定性，因此開(kāi)發(fā)基于病毒蛋白的診斷和檢測技術(shù)十分必要。SARS?CoV?2有四種種主要的結構蛋白，分別為刺突（S）蛋白、膜（M）蛋白、膜（E）蛋白和核衣殼（N）蛋白，這些蛋白包括多個(gè)抗原表位，我們可以依據這些表位來(lái)制備對應的抗體檢測病毒的存在，但制備抗原抗體耗費周期長(cháng)。病毒在感染人體后會(huì )產(chǎn)生相應的特異性抗體IgM和IgG，IgM抗體為機體最早產(chǎn)生的抗體，產(chǎn)生快，消失快，可作為早期感染的指標，適用于早期診斷。IgG晚于IgM產(chǎn)生，具有產(chǎn)生晚、消失慢的特點(diǎn)，可作為感染和既往感染的指標。因此我們可以通過(guò)檢測特異性抗體來(lái)證明病毒的存在。在第七版試行新型冠狀病毒肺炎診療方案中，新增了 COVID-19特異性免疫球蛋白抗體檢測以輔助確診。
2.1化學(xué)發(fā)光法
化學(xué)發(fā)光法是利用納米磁珠標記病毒的重組蛋白捕獲血液樣本中的病毒抗體IgM或者IgG抗體，利用與吖啶酯（吖啶酯是一類(lèi)可用作化學(xué)發(fā)光標記物的化學(xué)物質(zhì)）偶聯(lián)的二抗識別抗體，加入激發(fā)液后，通過(guò)相對發(fā)光強度測定靶物質(zhì)的量。納米磁珠具有較大的比表面積，便于操作可快速富集樣本中的血清抗體。化學(xué)發(fā)光法檢測的主要優(yōu)點(diǎn)包括采樣方便，操作簡(jiǎn)單、檢測時(shí)間短、成本低，適用于早
2.2膠體金免疫層析法
膠體金免疫層析技術(shù)是以膠體金作為示蹤標記物的一種新型免疫標記技術(shù)。 其主要是利用膠體金顆粒通過(guò)靜電作用可與蛋白質(zhì)分子結合的特點(diǎn)，將膠體金顆粒標記到SRAS?CoV?2重組抗原上作為免疫標記探針，當待測樣品經(jīng)過(guò)檢測試紙的層析作用后，如含有待測新冠抗體則可通過(guò)膠體金顆粒固定到檢測帶上，從而產(chǎn)生顯色條帶 [7] 。SRAS?CoV?2抗體膠體金檢測試劑盒，目前多用于體外定性檢測人血液樣本中的 SRAS?CoV?2 抗體（IgM/IgG），可在 10~15 min 得到檢測結果，為大規模人群復工、復學(xué)等提供快速、便捷的現場(chǎng)檢測手段。該方法操作方便，無(wú)需儀器設備，檢測時(shí)間短的優(yōu)勢，然而該方法僅能定性檢測，其檢測靈敏度和特異性較低。
2.3酶聯(lián)免疫法
酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法是將SARS-CoV-2抗原固定到載體上，捕獲人血清中的SARS-CoV-2的IgM/IgG抗體，再結合酶標記的抗IgM/IgG二抗抗體，利用酶與底物的顯色反應對待測物進(jìn)行定性和定量檢測方法。ELISA 法具有特異性強，靈敏度高的特點(diǎn)，儀器配置要求低，但ELISA檢測時(shí)間相對較長(cháng)，對實(shí)驗人員的操作技能和實(shí)驗場(chǎng)所安全防護的要求更高。
現階段我國疫情已有效控制，但國外疫情發(fā)展的趨勢不容樂(lè )觀(guān)，在全球化背景下，對于傳染性如此強大的疫病來(lái)說(shuō)，控制情況決定于最慢最差的地區，各國正在積極合作共同抗役，各衛生機構、生物技術(shù)公司和儀器公司開(kāi)發(fā)的檢測試劑和平臺略有不同，但都是圍繞核酸和抗體進(jìn)行檢測。對于國內，我們目前首要的任務(wù)仍是精準防控，以防疫情的反彈，精準防控的關(guān)鍵則是精準診斷。目前，批準上市的新型冠狀病毒肺炎檢測試劑主要包括核酸檢測試劑和抗體檢測試劑兩類(lèi)。核酸檢測是 COVID-19 輔助臨床診斷主要的手段，但是該方法存在一定缺陷，主要是受樣本采集儲存運輸、檢測試劑質(zhì)量以及實(shí)驗者操作等因素的影響，導致在低度感染者的咽拭子中難以檢測到病原體，從而影響確診[8]和兩次核酸檢測陰性的出院患者會(huì )出現 “復陽(yáng)” 的現象 [9]。因此我們輔助以血清抗體檢測能可有效彌補核酸檢測的不足。加強聯(lián)合方法的應用，檢測多個(gè)臨床指標，可有效提高實(shí)驗室檢測結果的準確率。當前，在病毒檢測試劑盒的產(chǎn)能滿(mǎn)足臨床需求的前提下，我們仍需技術(shù)創(chuàng )新，以提高新冠病毒檢測技術(shù)的準確性、擴大篩查通量、縮短檢測時(shí)間。
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