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作者：香雪生命科學(xué)-葉佳琳
發(fā)布時(shí)間：2023-03-29
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自DNA的雙螺旋結構被發(fā)現后，分子生物學(xué)就進(jìn)入了一個(gè)蓬勃發(fā)展期，人類(lèi)對于基因的探索興趣也越來(lái)越濃厚，生物的遺傳信息逐漸被破譯。同時(shí)在疾病治療方面，基因治療的出現給遺傳性疾病患者及腫瘤患者帶來(lái)了新希望。基因轉移技術(shù)是基因治療的關(guān)鍵影響因素之一，如何進(jìn)行有效的基因遞送并不斷提高基因的效率是研究者們一直以來(lái)在攻克的難題。常用的外源基因導入的方法包括物理法、化學(xué)法和生物法，接下來(lái)淺淺了解一下這幾種方法：
一、 物理法：
1. 基因槍法：
先將外源基因如DNA分子吸附于直徑約為4 μM的鎢粒或者金粒上，就像是組成了“子彈”。氣體基因槍利用壓縮氣體（氦或氮等氣體）作為動(dòng)力驅動(dòng)，將包裹著(zhù)DNA的金屬微粒子彈加速到一個(gè)很高的速度后，穿透細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)等結構到達細胞核，完成外源基因的導入[1]。基因槍轟擊可能對細胞造成較大的傷害，因此很少細胞符合基因槍法的要求。目前這種方法常用于植物細胞的基因轉導，轉化率高且重復性較好。
2.電激法：
電激即細胞電轉染，也叫做細胞電穿孔，是通過(guò)外部瞬時(shí)、高強度的電場(chǎng)作用，使細胞膜具有一定的通透性，并在電脈沖的作用下形成可逆性的穿孔，使得外源基因可以進(jìn)入。但基因并不是可以直接進(jìn)入細胞內的。細胞的細胞膜-細胞質(zhì)-細胞核在電場(chǎng)中就相當于是串聯(lián)電路，細胞膜的阻力比較大，在電場(chǎng)中的分壓就比較大，細胞質(zhì)的電阻較小則分得的電壓也很小，因此電場(chǎng)的作用只讓外源基因停留在細胞膜附近。接著(zhù)細胞本身的機制可以讓這些外源基因慢速擴散進(jìn)入細胞內。能承受電轉能量的細胞，細胞膜承受了大部分的電壓，其細胞核承擔的電壓微乎其微，因此電轉不會(huì )造成對細胞原本內部基因的毒性[2]。電轉的方法可以瞬時(shí)和穩定地表達外源基因，因此常用于科研領(lǐng)域的新藥開(kāi)發(fā)、癌癥研究、免疫學(xué)研究等。
3. 顯微注射法[4]：
顯微注射法是用針管極細的玻璃注射管，穿破細胞膜將外源基因直接打進(jìn)細胞內。因細胞膜具有一定的彈性和流動(dòng)性，因此細胞膜在被刺破后可進(jìn)行修復，恢復好的細胞可以繼續生長(cháng)。顯微注射法對于外源基因的長(cháng)度限制較寬松，可以導入大片段的基因片段，但對儀器以及操作方法要求及其嚴格，且一次只能操作少量細胞，因此不適用于需大量的研究，常用于轉基因植物或者克隆動(dòng)物的研究中。
4. 激光穿刺法
激光穿刺與電轉有相似之處，通過(guò)微米級的激光光束在細胞上穿孔，使外源基因進(jìn)入細胞內。在激光處理前，細胞需先在高滲溶液中浸泡一定的時(shí)間，使細胞內保持較高的滲透壓，當激光處理細胞后，外源基因便因為細胞內外形成的滲透壓差，通過(guò)穿刺的小孔進(jìn)入細胞內[5]。這種方法操作比較簡(jiǎn)便、受體材料范圍廣且不受轉化方法的限制。此方法在有植物細胞或組織的基因工程中具有廣泛的應用前景。
5. 超聲波法[3]
超聲波法主要利用的是空化作用，即超聲波的作用下，液體中球形的空化泡在崩潰的瞬間，其內部可產(chǎn)生高溫高壓，此時(shí)可能出現電離和放電效應，使在空泡周?chē)募毎诤唾|(zhì)膜破損或者發(fā)生可逆性的通透性改變，從而發(fā)生細胞內外物質(zhì)的交換，使得溶液中的外源基因進(jìn)入細胞內。
6. 碳化硅纖維法
碳化硅纖維是一種以有機硅化合物為原料，具有β-碳化硅結構的無(wú)機纖維。將懸浮細胞與DNA和碳化硅纖維混合并震蕩培養，DNA與碳化硅纖維混合后可依附在其表面，碳化硅纖維在與細胞相互碰撞過(guò)程中可以刺穿細胞，進(jìn)而將DNA導進(jìn)細胞內。這種方法轉導DNA的成本低易操作且可以控制導入DNA的量，但是也會(huì )對細胞造成及較大的傷害，因此通常應用于具有細胞壁的植物細胞基因轉導中。
二、 化學(xué)法：
1. 聚乙二醇(PEG)法
聚乙二醇(PEG)是由環(huán)氧乙烷與水或乙二醇聚合而成的高分子聚合物。PEG無(wú)色無(wú)毒無(wú)刺激性氣味，具有一系列的分子量，與水有較好的相溶性。PEG的表面帶正電，可與帶負電的DNA分子通過(guò)靜電作用結合，從而在DNA分子上形成PEG包膜。PEG可以與細胞膜粘合進(jìn)而擾亂細胞膜的磷脂雙分子層，使細胞膜表面的膜電位紊亂，干擾細胞膜的識別作用。高濃度PEG具有高親水性，可吸附溶液中的自由水分子，從而使細胞膜和DNA分子之間形成分子橋，促進(jìn)兩者的接觸粘合使DNA得以進(jìn)入細胞內[6]。PEG包裹法在基因治療研究的前期探索階段應用較為廣泛，在幫助基因導入的前提下降低了外源基因對細胞的傷害。
2. 磷酸鈣-DNA共沉淀
磷酸鈣-DNA 共沉淀法(calcium phosphate-DNA coprecipitation)是先將DNA與氯化鈣（CaCl2）混合，然后加入到PBS或者HEPES等帶有磷酸根基團的溶液中，正電荷的鈣離子會(huì )與負電荷的磷酸根離子形成沉淀，同時(shí)DNA也會(huì )吸附在上面。將帶有沉淀的懸液滴入細胞培養皿中與細胞共培養，細胞可以吞噬沉淀，進(jìn)而將DNA帶入細胞內。這種方法常用于單層貼壁細胞的基因轉導中，是成本較低且簡(jiǎn)易的轉導方法。但是這種方法的轉染效率較低，很多時(shí)候不能滿(mǎn)足研究工作的需要。
3. 脂質(zhì)體法
細胞膜是由磷脂雙分子組成的，想跟它打好關(guān)系最好的辦法就是融入它。因此便有了脂質(zhì)體轉染法。脂質(zhì)體也被叫做人工細胞膜，具有磷脂雙分子層。表面帶正電荷的脂質(zhì)體與DNA（或RNA）分子的磷酸根通過(guò)靜電作用結合，脂質(zhì)體將分子包裹在內，細胞膜的表面也是帶負電荷的，因此可以吸附脂質(zhì)體，最后融合通過(guò)內吞的方式將分子帶入細胞內。這種方法的基因轉導率高，而且不僅可以轉導小片段基因分子，對于大片段的基因分子也有很高的轉導效率，因此在科研研究中得到了非常廣泛的應用[7]。但是脂質(zhì)體轉染法的成本較高，具有一定的細胞毒性，不適用于大劑量的研究。
三、 生物法：
生物法大多用于植物的轉基因研究中。
1. 農桿菌介導法
農桿菌是一類(lèi)革蘭氏陰性的細菌。農桿菌中的根癌農桿菌上有一種可以使植物產(chǎn)生腫瘤的質(zhì)粒，叫做Ti質(zhì)粒(Tumor inducing plasmid）。Ti質(zhì)粒上有一小段可以進(jìn)入植物細胞內部的序列（T-DNA，Transfer DNA）。T-DNA可以插入到植物細胞的基因中，因此研究者則通過(guò)改造T-DNA，將外源基因插入到T-DNA中，然后通過(guò)農桿菌侵染植物細胞便可以獲得轉基因植物。受感染的植物細胞需為受傷的雙子葉植物細胞，其會(huì )釋放一些生物信號，這些信號吸引農桿菌靠近，吸附于植物細胞表面。隨后農桿菌上T-DNA的毒粒基因被激活表達，幫助引導DNA穿過(guò)農桿菌的內外膜以及植物細胞的細胞壁、內外膜和核膜，而農桿菌并不會(huì )進(jìn)入細胞[8]。農桿菌介導是天然的植物遺傳轉化系統，在轉基因植物的研究中受到了廣泛的青睞。
2. 花粉管通道法[9]
植物細胞在開(kāi)花授粉后，會(huì )形成花粉管，花粉管伸長(cháng)后借助助細胞進(jìn)入胚囊中。人工將外源基因借助花粉管導入胚囊中，外源基因進(jìn)一步整合到早期還沒(méi)有形成細胞壁的合子中，形成有外源基因的胚，最后經(jīng)過(guò)培養以及篩選得到目的產(chǎn)物。花粉管通道法不用依賴(lài)于植物細胞組織培養，可以直接得到轉基因的種子。
3. 浸漬法
浸漬法是植物細胞基因轉導最簡(jiǎn)單，成本最低的方法。該方法即是通過(guò)將植物的種子、胚、胚珠、子房或者懸浮細胞直接浸潤在含有外源基因的溶液中，通過(guò)細胞自身的滲透作用將外源基因導入細胞中。這種方法的轉化效率低，重復率差，過(guò)程的篩選也比較困難。
4. 病毒介導法
病毒大家也都不陌生了。簡(jiǎn)單的病毒是由核酸（DNA或RNA）作為中心，和蛋白質(zhì)組成的外殼構成的。病毒不能自主繁殖，必須借助活細胞內的物質(zhì)和能量進(jìn)行繁殖。病毒具有較強的感染能力，通過(guò)基因工程手段改造病毒基因組，將外源基因插入病毒基因組中，成為外源基因的運送載體，隨后將病毒載體進(jìn)行包裝，制備成攜帶外源基因且具有細胞感染能力的病毒顆粒。改造后的病毒感染宿主細胞，外源基因進(jìn)入細胞內，并進(jìn)行長(cháng)期的基因表達。目前最常用的病毒載體有逆轉錄病毒(Retrovirus，RV）、腺病毒(Adenovirus，ADV)和慢病毒(Lentivirus，LV)。病毒介導法的受體細胞廣泛，可以滿(mǎn)足植物細胞以及動(dòng)物細胞的基因轉導，轉導效率高且基因表達較穩定，是目前基因治療研究中常用的基因轉導方法[10]。
基因轉導在動(dòng)植物的研究中具有重要的意義，轉基因食品的出現大大提高了農作物的產(chǎn)量、減少了害蟲(chóng)的傷害；基因治療的研究為癌癥病人帶來(lái)了新希望。基因轉導雖然帶來(lái)了諸多益處，但對生物體來(lái)說(shuō)屬于外源物質(zhì)，存在基因突變導致機體調控失調等的風(fēng)險，因此對于轉導基因的設計、轉導方法的選擇等都需要長(cháng)時(shí)間的研究摸索。
參考文獻：
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