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作者：香雪生命科學(xué)-翁志明
發(fā)布時(shí)間：2023-08-31
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適配體（aptamer）這個(gè)術(shù)語(yǔ)源自拉丁文"aptus"（適合）和"meros"（部分），意為適合特定目標的分子片段。適配體是一段長(cháng)度為15-100個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列，能夠高親和性結合特定的目標分子。自從1990年篩選適配體的技術(shù)公布以來(lái)，隨后的研究擴展了適配體的范圍，不僅包括RNA適配體，還包括DNA適配體。適配體已經(jīng)在環(huán)境監測、食品安全、臨床診斷和疾病治療等領(lǐng)域展現出廣泛的應用潛力。本文將對適配體的類(lèi)型、結構和性質(zhì)、適配體的篩選方法、適配體的應用等方面進(jìn)行簡(jiǎn)要的介紹。
適配體的類(lèi)型
適配體也稱(chēng)為核酸適配體，最常使用的是單鏈DNA和RNA這兩種類(lèi)型。單鏈DNA適配體具有高度靈活性，能夠通過(guò)形成二級或三級結構與目標分子相互作用，實(shí)現高度特異的識別和結合。而RNA適配體具有更強的結構多樣性和功能多樣性，在某些情況下可能更具優(yōu)勢。雙鏈DNA適配體則相對較少使用，只在某些特定情況下仍具有應用價(jià)值。研究人員會(huì )根據實(shí)驗需求和目標分子的性質(zhì)選擇最適合的核酸適配體類(lèi)型，以實(shí)現最佳的結合和識別性能。
適配體的結構和性質(zhì)
適配體與各種靶分子（小分子、蛋白質(zhì)、細胞等）結合是基于單鏈核酸結構和空間構象的多樣性，它可以通過(guò)鏈內某些互補堿基間的配對以及靜電作用、氫鍵作用等自身發(fā)生適應性折疊，形成一些穩定的三維空間結構。
具體來(lái)說(shuō)，適配體可以形成以下幾種常見(jiàn)的結構：
二級結構包括單鏈結構和部分雙鏈結構。①單鏈結構：適配體大部分是單鏈的DNA或RNA，它可以呈現線(xiàn)性的單鏈結構。單鏈結構中的堿基序列按照從5'端到3'端的順序排列。②部分雙鏈結構：適配體的一部分序列可能會(huì )通過(guò)堿基互補配對形成部分雙鏈結構，其中部分區域的堿基會(huì )相互配對，而其他區域則保持單鏈結構。
三級結構包括簇狀結構和伸展結構。①簇狀結構：適配體的部分或全部區域可能會(huì )通過(guò)內部堿基間的氫鍵和其他相互作用力形成簇狀結構。這些結構通常是非常短的局部結構，例如發(fā)夾狀結構（hairpin loop）和內環(huán)結構（internal loop）。②伸展結構：某些適配體可以形成更復雜的伸展結構，例如莖環(huán)結構（stem-loop）和多分支結構（multibranch loop）。這些結構通常由堿基間的配對和G-四鏈體（G-quadruplex）等相互作用形成。
適配體的二級結構和三級結構是動(dòng)態(tài)的，并且可以在不同條件下發(fā)生結構的變化。這種結構的靈活性和可變性是適配體在識別和與其他分子相互作用時(shí)的關(guān)鍵特性。
適配體被稱(chēng)為“化學(xué)抗體”。和傳統抗體相比，適配體具有以下優(yōu)勢：①靶分子范圍更廣，可以是重金屬、有機染料、氨基酸、抗生素、維生素、蛋白質(zhì)、多糖，甚至是細胞、致病菌、病毒、組織等。而傳統抗體的靶標一般是具有免疫原性的大分子。②分子量更小（15-30 kD）。③免疫原性更低、毒性更小。④組織滲透性更強。⑤通過(guò)化學(xué)合成，生產(chǎn)成本更低。
適配體的篩選方法
適配體通過(guò)指數級富集的配體系統進(jìn)化技術(shù)（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，簡(jiǎn)稱(chēng)SELEX）來(lái)篩選獲得。SELEX技術(shù)最早是由Craig Tuerk和Larry Gold在1990年8月發(fā)表在Sciense期刊上的文章公布出來(lái)，他們以T4 DNA聚合酶作為目標分子，并通過(guò)多輪的選擇、放大和分離步驟，逐步篩選出對T4 DNA聚合酶具有高親和力和特異性的RNA適配體。
作為篩選適配體的一種實(shí)驗方法，SELEX技術(shù)一般包括以下五個(gè)步驟：
①庫的構建：SELEX的第一步是構建一個(gè)包含大量隨機序列的DNA或RNA庫。這個(gè)庫通常由長(cháng)度為15-100個(gè)核苷酸的隨機序列片段組成，其中每個(gè)位置上的堿基都是隨機的。這些隨機序列片段通常被合成為寡核苷酸，并通過(guò)連接適當的引物序列來(lái)方便后續的PCR擴增。庫的容量一般介于1013-1016。
②選擇步驟：選擇步驟是適配體的篩選過(guò)程，它通過(guò)與目標分子的結合來(lái)富集具有高親和力的適配體。這個(gè)過(guò)程通常包括以下幾個(gè)步驟：a.結合：將隨機序列庫與目標分子（如小分子化合物、蛋白質(zhì)等）進(jìn)行反應，特異性的核酸片段會(huì )結合目標分子。b.分離：通過(guò)適當的方法（如凝膠電泳、柱層析等）將特異性結合的核酸片段與未結合的片段分離。c.放大：將分離的核酸片段進(jìn)行PCR擴增，以增加其數量。
③反復迭代：經(jīng)過(guò)第二步的選擇步驟后，得到的核酸片段被重新引入到下一輪選擇步驟中進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。這個(gè)過(guò)程通過(guò)多輪的結合、分離和放大（6-20次連續循環(huán)）來(lái)逐漸富集具有更高親和力的適配體。每一輪選擇的條件可以根據需要進(jìn)行調整，以獲得更好的篩選效果。
④高親和力篩選和序列分析：經(jīng)過(guò)多輪迭代后，進(jìn)行最終的高親和力篩選。在此階段，可以采用更嚴格的篩選條件來(lái)篩選具有最強結合能力的適配體。選定的適配體經(jīng)過(guò)測序分析以后確定其序列。
⑤適配體的驗證和應用：選定的適配體需要進(jìn)行進(jìn)一步的驗證，確認其對目標分子的特異性結合和親和力。可以使用表面等離子共振（SPR）、生物層干涉 (BLI) 、流式細胞分析等技術(shù)進(jìn)行驗證。一旦驗證成功，適配體就可以在不同的應用領(lǐng)域中使用，如生物傳感、藥物遞送、疾病診斷和治療等。
在傳統SELEX技術(shù)的基礎上，研究人員根據不同的靶標對SELEX技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化：篩選小分子的方法主要有硝酸纖維素膜過(guò)濾法、親和層析法等；篩選蛋白質(zhì)、多糖等大分子的方法有毛細管電泳SELEX、光敏SELEX、親和層析法、磁珠分離法、高速離心法等；篩選病原菌和細胞的方法有細胞SELEX。這些優(yōu)化的SELEX技術(shù)顯著(zhù)提高了適配體的篩選效率。
適配體的應用
適配體可以與各種靶分子（小分子、大分子、細胞等）實(shí)現高度特異性和高親和性（平衡解離常數KD值介于nM-pM之間）的結合。將適配體與適當的傳感器或信號放大系統結合，可以實(shí)現對目標分子高靈敏度的檢測和分析。適配體在環(huán)境監測、食品安全、臨床診斷和疾病治療等方面具有廣泛的應用潛力。
環(huán)境監測
水質(zhì)和土壤監測：通過(guò)選擇與特定的水污染物、土壤中的有害物質(zhì)（如重金屬、農藥、有機物等）結合的適配體，可以實(shí)現對水樣和土壤中目標物質(zhì)的高靈敏度和選擇性檢測。
大氣污染監測：適配體可用于檢測空氣中的有害氣體或顆粒物。例如，適配體可以與揮發(fā)性有機化合物（VOCs）或細顆粒物（PM2.5、PM10等）結合，從而實(shí)現對空氣質(zhì)量的監測和分析。
食品安全
食品中有害物質(zhì)檢測：適配體可以用于檢測食品中的有害物質(zhì)，如重金屬、農藥、毒素等。通過(guò)選擇與目標物質(zhì)結合的適配體，可以實(shí)現對食品中有害物質(zhì)的高靈敏和選擇性檢測。
食品質(zhì)量監測：適配體可以用于檢測食品中的營(yíng)養成分、添加劑或其他關(guān)鍵指標，從而實(shí)現食品質(zhì)量的監測和評估。
臨床診斷
適配體可以用于檢測特定的生物標志物，如腫瘤標志物、病原體蛋白或細胞表面受體等。適配體的高度選擇性和親和性使其能夠實(shí)現對這些標志物的靈敏檢測，并可以與傳感器或檢測平臺結合，構建出高效、準確的診斷工具。
疾病治療
通過(guò)篩選疾病相關(guān)特定靶分子的適配體，有可能作為運載工具或者直接作為藥物來(lái)治療相關(guān)的疾病。目前已有多種疾病相關(guān)的適配體被篩選出來(lái)，涉及到脈絡(luò )增生血管、血管內血栓、急性冠狀綜合癥、血管瘤、骨髓性白血病、腎癌、骨骼肌疾病、病毒感染（人乳頭瘤病毒（HPV）、單純皰疹病毒（HSV）、乙肝病毒（HBV）、人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）、新冠病毒（SARS-CoV-2））等。
在腫瘤的治療方面，通過(guò)選擇與腫瘤細胞表面分子（如受體）結合的適配體，可以實(shí)現對腫瘤細胞的特異性識別和定位。適配體可以被用作靶向藥物的運載工具，將抗癌藥物精確地遞送到腫瘤細胞，并減少對正常細胞的損害。適配體也可以像抗CTLA-4抗體和抗PD-1/PD-L1抗體那樣作為免疫檢查點(diǎn)抑制劑，通過(guò)結合到免疫檢查點(diǎn)分子上，適配體可以干擾腫瘤細胞與免疫細胞之間的抑制性信號傳導，從而恢復免疫細胞對腫瘤的攻擊能力。
適配體通過(guò)臨床試驗以后可以申請上市來(lái)治療相關(guān)的疾病。2004年12月17日，FDA批準了注射劑Macugen用于治療新生血管性（濕性）年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）。Macugen是一款聚乙二醇化的修飾性寡核苷酸藥物，能夠靶向結合血管內皮生長(cháng)因子（VEGF165亞型），阻止異常血管形成并減少黃斑變性的進(jìn)展。給藥方式為玻璃體內注射。Macugen是第一款治療AMD的藥物，它的上市是適配體應用的一個(gè)重要里程碑。但遺憾的是，后來(lái)療效更好的抗體藥物L(fēng)ucentis (Ranibizumab)上市以后，Macugen最終黯然退市了。這么多年過(guò)去了，目前適配體藥物的臨床試驗也寥寥無(wú)幾，數量遠遠比不上抗體。反映出適配體作為藥物在治療疾病方面，可能存在一些難點(diǎn)，還需要對適配體的選擇、親和性和穩定性等方面做進(jìn)一步的研究和開(kāi)發(fā)。
結論和展望
經(jīng)過(guò)三十多年的發(fā)展，適配體已經(jīng)成為除抗體以外的另外一種好用的分子識別工具。它們和各種靶分子的特異性識別和高親和性的結合能力為研究人員提供了豐富的資源和工具。適配體已經(jīng)在環(huán)境監測、食品安全、臨床診斷和疾病治療等方面具有廣泛的應用潛力。雖然目前適配體實(shí)際的應用情況、臨床轉化等方面和抗體相比差距很大，但我們仍然相信隨著(zhù)技術(shù)的改進(jìn)和創(chuàng )新，適配體應該有機會(huì )獲得更多的應用。
參考文獻：
1. Craig Tuerk, Larry Gold. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science, 1990, 249(4968): 505-510.
2. Shuanghui Yang, Huan Li, Ling Xu, et al. Oligonucleotide Aptamer-Mediated Precision Therapy of Hematological Malignancies. Molecular Therapy: Nucleic Acids, 2018, 13: 164-175.
3. Jing Han, Liang Gao, Jinsheng Wang, Jia Wang. Application and development of aptamer in cancer: from clinical diagnosis to cancer therapy. Journal of Cancer, 2020, 11(23): 6902-6915.
4. Shuming Sun, Han Liu, Yan Hu, et al. Selection and identification of a novel ssDNA aptamer targeting human skeletal muscle. Bioactive Materials. 2023, 20: 166-178.
5. Tomasz Wandtke, Ewelina Wedrowska, Marcin Szczur, et al. Aptamers—Diagnostic and Therapeutic Solution in SARS-CoV-2. International Journal of Molecular Sciences. 2022, 23, 1412.
6. Yang Zhang, Mario Juhas, Chun Kit Kwok. Aptamers targeting SARS-COV-2: a promising tool to fight against COVID-19. Trends in Biotechnology, 2023, 41(4): 528-544.
7. 王周平, 張維瀟. 適配體及其研究進(jìn)展. 食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2013, 32(9): 897-906.
